常见问题
Q&A
如实验室的扩增产物泄露，造成实验室的污染，那么后果将非常严重。要去除污染，
①首先最重要的是保持通风，保证扩增产物片段能顺利扩散出去；
②其次可采用稀酸处理法，对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；
③再次采用紫外照射法，紫外波长（nm）一般选择254/300nm，需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大；
④最后若污染长时间不能消除，建议更换另外厂家的PCR试剂进行检测。
要判断自己的PCR仪器是否正常，可从以下几方面考虑：
1.仪器开关机，与软件连接是否正常。
2.仪器运行同样的实验所需要的时间是否跟平时一致，由此判断仪器的加热制冷模块是否正常。
3.曲线结果是否呈明显的S型，若曲线异常，如呈曲折上升状，则可能是热盖问题，或者是荧光检测装置出现问题，或者是电压问题。
4.若曲线的荧光值与平时相比，明显降低，则要考虑是否需要更换仪器光源（尤其是卤素灯，其光源寿命约2000h）。
5.若仪器某一孔或几孔的荧光值明显高于其他孔位，则需要考虑仪器的孔槽或检测光路是否受到荧光污染，建议清洗仪器孔槽后并校准后再进行测试。
1）为了保证检测质量，PCR实验室应有充分合理的空间，良好的照明和空调设备。工作环境虽不是检测质量的直接原因，但宽敞舒适的实验室环境将肯定有利于检验质量的保证。
2）合理有效地对仪器设备进行管理，定期做维护和校准，使其处于一个良好的状态。例如，定期校准移液器，使其保持足够的准确度和精密度。定期维护荧光定量PCR仪的光学系统和反应孔间温度差异，使其保持在良好状态和允许的范围内。此外，还包括天平，离心机，冰箱等设备的管理。
3）理想的试剂：主要有内外两个因素，内在因素包括标本处理方法，用于核酸扩增的原材料及方法学设计等。外出因素包括试剂盒的运输和保存中的问题。
4）标准化操作流程：完整的PCR程序由标本采集，运送，保存，编号，试剂准备，核酸提取，扩增和产物检测，结果分析和报告等诸多环节，建立科学和与本实验室配套的SOP文件，严格按SOP进行操作。
5）主要污染源和防污染措施：PCR的主要污染源有标本中的大量待测微生物，克隆质粒，大量存在实验室中的特定微生物以及以前扩增产物的残留污染等。这些都是实验室最容易造成假阳性的污染。因此，必须严格分区实验室及遵守工作流程，使用化学清洁实验台面，使用紫外线照射和UNG方法消除扩增产物污染等等。
6）进行室内和室间质量控制，室内质量控制可以确保实验室室内测定质量的一致性，室间质量控制可以提供将实验室测定情况与一室间和客观标准进行回顾性比较的数据。
实时荧光定量PCR扩增曲线包括基线期，指数扩增期，线性扩增期和扩增平台期，标准的曲线应该呈典型的S型。不规则曲线可以根据曲线的具体情况来分析：
1）曲线呈斜线上升原因：热盖失灵或热盖没盖紧，导致控温不准、液体挥发。解决办法:更换仪器热盖或将热盖盖紧。
2）扩增曲线分成两段（断裂）原因：基线的终点大于Ct值，通常是因为模板DNA浓度偏高，CT值< 15，而基线仍然取3-15，其中包含部分扩增信号，导致曲线被压下去。解决方法：减小基线终点，至Ct值前4个循环，重新分析数据。
3）直线扩增曲线，某些样本出现直线扩增曲线原因：探针部分降解解决办法:建议更换试剂进行测试。
4）曲线平台期下掉原因：盖子没盖紧解决办法:PCR反应管盖子盖上后，检查盖子是否盖紧。
⑴假阴性判断：造成假阴性结果的原因有很多，主要体现在FAM扩增曲线不起来，原因包括标本抑制，核酸提取失败，基因突变以及仪器故障等。 目前国内主流PCR试剂都不带内标监控功能，用于检测目标基因的FAM扩增曲线既用来定量又用于定性（判断阴阳性），因此FAM扩增曲线的好坏非常关键。
同时，对于拥有竞争性内标监控功能的试剂来说，可有以下四种情况发生：
①如FAM无扩增，内标有扩增：结果正常，判断该样本为阴性结果；
②如FAM无扩增，内标也无扩增：结果异常，可能原因核酸提取失败或有抑制，一定要重复实验；
③如FAM有扩增，内标有扩增：结果正常，因为待测核酸和内标在同一反应体系下扩增；
④如FAM有扩增，内标无扩增：结果正常，强阳性样本会抑制内标的扩增，导致内标结果偏弱或阴性。
⑵假阳性判断（如何判定）：PCR检测当中造成假阳性结果的情况比较少，原因包括试剂污染，气溶胶污染，操作污染，扩增产物污染，非特异性扩增，耗材污染等，所以建议一定要做阴性对照来监控是否存在污染。
1.仪器使用的广泛程度
如果不是一个新出现的仪器品牌，为保证所购置的仪器有充分的可靠性，PCR实验室可以从相应仪器在国内外使用的广泛程度来判断。应用越是广泛的仪器，越是经过实践验证的，也就越具有可靠性。
2.仪器的检测通量（反应孔数）
在购买定量PCR仪的时候需要根据实验室的要求来选择不同通量的仪器。目前市面上的荧光定量PCR仪的检测通量小到16多到384孔，实验室可以根据自己的检测项目和发展状况，选择合适的仪器，没必要追求最昂贵的仪器，一般来说，96孔的通量足够用了；其它视情况而定。
3.仪器的通道数量
随着开展的项目越来越多，比如基因表达，单核苷酸多态性分析、高分辨率熔解曲线等，那么单通道的仪器则无法满足实验室的需求了，而多通道的设计则能使其更方便地检测多重PCR检测及其衍生的基因表达等其他分析模式。
4.耗材的开放性
耗材如扩增反应管的开放性可能会决定日常检测成本的高低。作为PCR实验室，在选择实时荧光PCR仪时，可考虑这一点。不过对于检测病原体遗传物质为RNA的项目的时候，尽量使用去RNAnase酶耗材。
5.硬件设计特点
荧光定量PCR仪主要有96孔板式和离心式等，每种设计都有它的独到之处，但也都有无法避免的缺陷。
96孔板的荧光定量PCR仪可以容纳的样本量大，最大可至100ul，而且无需特殊的耗材。传统的96孔板仪器多采用卤钨灯激发、CCD检测。其优点在于：卤钨灯的光强比LED灯强，波长范围广，对于荧光染料的激发具有非常好的效果，性能比较稳定，使用寿命约3000个小时左右；但CCD的检测通常会因为每个样品孔距光源和检测器的光程各不相同，会产生边缘效应，对结果产生一定的影响。离心式的仪器通常选用LED激发、PMT检测，设计上避免了边缘效应，同时PMT检测对荧光信号可以放大或缩小，相对于CCD检测更加灵活，灵敏度更高；但LED的荧光强度比较弱，波长范围也比较窄，因此，对荧光染料的激发效果不如卤钨灯；
6.运行速度
在荧光定量PCR仪的众多技术参数中，升降温速度也是非常重要的。更快的升降温，可以缩短反应进行的时间，而且缩短了可能的非特异性结合和反应时间，提高PCR的特异性。但是，运行速度越快，对加热制冷模块的要求越高，因此，稳定性是其存在的最大问题，如果在市面上经过长期考证的，稳定性好的仪器，运行速度越快，带来的便捷越多；
7.灵活性
在仪器基本性能得到保证的情况下，另外一方面则需要考虑仪器的灵活性，主要包括：仪器运输的灵活性，拆卸的灵活性，软件升级的灵活性，模块更换的灵活性以及使用的灵活性等。
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